Técnicas de Investigación en Nutrición y Farmacología

Introducción a la Investigación en Nutrición

Los cimientos de la ciencia de la Nutrición se construyeron gracias a pioneros como Max Rubner, quien en 1984 definió la termodinámica específica de los alimentos. François Magendie (1816) y Justus Liebig (1803-1873) establecieron la esencialidad de las proteínas como ‘materiales de construcción’. Pekelharing (1905), Hopkins (1912) y Casimiro Funk identificaron ‘factores asociados a la alimentación’ como ‘reguladores metabólicos’. Francisco Grande Covián (1909-1995) sentó las bases del ‘progreso de la ciencia de la Nutrición’.

Planteamiento de un Proyecto de Investigación

Fase Preliminar

  1. Definir la pregunta de investigación.
  2. Revisar antecedentes: Conocimiento actual sobre el tema (revisión bibliográfica).
  3. Establecer la pregunta a responder (clara y sin ambigüedades).
  4. Justificar el estudio.

Planteamiento de la Hipótesis

  1. Formular una hipótesis que dé respuesta a la pregunta de investigación.
  2. Identificar:
    • Factor a estudiar.
    • Población de estudio.
    • Método de medición o evaluación.
  3. Establecer un plan para la resolución de la hipótesis.

Fase Experimental u Observacional

  1. Diseñar el estudio.
  2. Seleccionar la tecnología a emplear.
  3. Definir los análisis estadísticos.

Conclusiones

  1. Elaborar una memoria del trabajo realizado.
  2. Determinar si se ha demostrado la hipótesis y analizar las consecuencias.

Cultivos Celulares

Los cultivos celulares son organismos experimentales utilizados para obtener conclusiones generalizables a otras especies.

Tipos de Cultivos Celulares

  1. Cultivo de órganos: Tejido ‘in vivo’ mantenido en un medio que proporciona nutrientes y elimina desechos. Ventajas: réplica del tejido de origen. Desventajas: crecimiento limitado, heterogeneidad.
  2. Explantes primarios: Fragmentos de tejidos u órganos que se adhieren a una superficie y proliferan.
  3. Cultivos celulares: Células disgregadas (enzimática o mecánicamente) que crecen en monocapa o suspensión. Permiten la propagación celular y el estudio de la actividad intracelular.
    • Cultivo primario: Células o tejidos que crecen sin haber pasado por una fase de crecimiento in vitro previa.
    • Cultivo secundario: Células que proceden de una fase previa de crecimiento in vitro.

Línea Celular Continua

Líneas celulares con potencial proliferativo ilimitado «inmortale») obtenidas por transformación espontánea o manipulación genética. Ejemplo: línea celular HeLa (Henrietta Lacks). Ventajas: control preciso, homogeneidad, ética. Desventajas: complejidad técnica, inestabilidad, validez del modelo ‘in vitro’.

Mantenimiento de Cultivos Celulares

Los cultivos celulares requieren un medio isotónico y estéril con capacidad tamponadora (pH 7-7,3), soporte de cultivo, fase gaseosa (O2 y CO2), salas de cultivo específicas y cabinas de flujo laminar.

Modelos Animales

Especie animal mantenida bajo condiciones controladas para fines científicos. Se debe aplicar el principio de las tres ‘Rs’: Reemplazo, Reducción y Refinamiento.

Clasificación de Áreas según Control Microbiológico

  • Unidad convencional (Haloxénicos): Animales sin ningún proceso especial.
  • Unidad barrera (Gnotobióticos, inmunodeficientes): Libres de gérmenes, excepto microbiota específica introducida.
  • Aislamiento (Axénicos): Animales sin microorganismos detectables.

Ensayos Clínicos Farmacológicos

Estudios Preclínicos

Evalúan el efecto, absorción, metabolismo y toxicidad en células o animales. Duración: 3-4 años.

Estudios Clínicos (Humanos)

  1. Fase I: Seguridad, tolerancia, dosis. Participantes: 20-50 personas sanas. Duración: 1-2 años.
  2. Fase II: Eficacia y seguridad. Participantes: 100-300 enfermos. Duración: 2-3 años.
  3. Fase III: Comparación con otros tratamientos, efectos secundarios. Participantes: Miles de enfermos. Duración: 2-4 años.
  4. Aprobación y Comercialización
  5. Fase IV: Vigilancia, actualización, nuevos usos. Participantes: Millones de enfermos.

Estudios de Intervención Nutricional

Requieren permisos éticos y consentimiento informado. La selección de la muestra debe considerar criterios de inclusión/exclusión y técnicas de enmascaramiento.

Ensayos Controlados

  1. Controlado paralelo.
  2. Controlado cruzado.
  3. Controlado no aleatorio.

Ensayos No Controlados

  • Antes-después con intervención.

Estudios Descriptivos

Analizan la frecuencia y distribución de un fenómeno sin evaluar la relación causa-efecto.

Estudios Ecológicos

Analizan grupos de individuos (poblaciones o comunidades) y criterios geográficos o temporales. Son rápidos, económicos y útiles para explorar nuevas hipótesis. Sin embargo, son propensos a sesgos ecológicos y de confusión.

Estudios Transversales

Estudios observacionales y descriptivos que analizan sujetos individuales en el presente. Son económicos y permiten determinar la prevalencia de enfermedades, factores dietéticos y problemas nutricionales. Útiles para plantear hipótesis.

Estudios Analíticos

Evalúan la relación causal entre un factor y un efecto.

Estudios de Casos y Controles

Estudios observacionales, analíticos y longitudinales que comparan un grupo control con un grupo de casos para determinar las causas de una enfermedad. Son útiles para enfermedades raras o con largos periodos de latencia. Tienen un coste moderado y una duración corta, pero son propensos a sesgos de selección e información. Se utiliza la medida de asociación Odds Ratio (OR).

Estudios de Cohortes

Estudios observacionales, analíticos y longitudinales que siguen a un grupo de personas con una experiencia en común durante un tiempo determinado. Son costosos, largos y difíciles de reproducir, pero tienen menor probabilidad de sesgo. Son útiles para enfermedades comunes y frecuentes. El diseño incluye selección de participantes, evaluación inicial, seguimiento, documentación clínica y análisis de la exposición.

Jerarquía de la Evidencia Científica

Metaanálisis > Ensayos controlados aleatorios > Ensayos controlados > Ensayos clínicos > Cohorte > Casos y controles > Transversales > Estudios de series de casos > Estudios in vitro y modelos animales > Opiniones de expertos.

Determinación de la Capacidad Antioxidante

ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)

Mide la capacidad de absorber radicales libres. Se calcula el área bajo la curva de la muestra y se compara con el antioxidante de referencia Trolox. ORAC 5 es la medida más precisa, considerando radicales como peroxilo, oxígeno singlete, hidroxilo, superóxido y peroxinitrito.

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

Mide la capacidad de reducir Fe3+ a Fe2+.

Determinación de Antioxidantes Específicos

  • Ácido ascórbico: Colorimetría DNPH/HPLC-DAD.
  • Alfa-tocoferol: HPLC-Fluorescencia.
  • Polifenoles: Espectrometría – UV/HPLC-DAD.
  • Carotenoides: HPLC-DAD.

Sistemas Enzimáticos de Defensa Antioxidante

  • Glutation peroxidasa.
  • Glutation reductasa.
  • Catalasa.
  • Superóxido dismutasa (SOD).

Biomarcadores de Estrés Oxidativo

  • Isoprostanos: Productos de oxidación del ácido araquidónico o EPA.
  • Malondialdehído (MDA).
  • 8-hidroxi-2′-desoxiguanosina (8-OHdG): Marcador de daño oxidativo del ADN.
  • Glutation.

Mediadores de Actividad Antioxidante Endógena

  • Albúmina: Previene la descomposición de hidroperóxidos.
  • Bilirrubina: Reacciona con radicales peroxilo.
  • Ácido úrico: Reacciona con radicales hidroxilo y compleja metales.

Detección de Cambios en la Expresión Génica

Técnicas Específicas

  • PCR cuantitativa (PCRq) con Sybr Green o sonda TaqMan. La fase exponencial es la más fiable para cuantificar. El ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la cantidad de ADNc.

Técnicas Globales

  • Microarrays de ADNc.

Técnicas Cromatográficas

Cromatografía

Técnica de separación de sustancias basada en su diferente afinidad por una fase estacionaria (gel de sílice) y una fase móvil (líquido o gas). La separación se produce por la diferente velocidad de desplazamiento de las sustancias a través de la columna cromatográfica.

Cromatografía de Gases

Fase estacionaria líquida y fase móvil gaseosa. Se utiliza para separar sustancias volátiles.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Fase estacionaria sólida y fase móvil líquida. Existen diferentes tipos de HPLC según la fase estacionaria: adsorción, partición, intercambio iónico y tamaño. Se utiliza para separar una amplia variedad de sustancias.

Otras Técnicas de Análisis

RMN (Resonancia Magnética Nuclear)

Técnica que aprovecha la resonancia de los núcleos atómicos en un campo magnético para obtener información estructural y dinámica de las moléculas.

Espectrometría de Masas

Técnica que determina la distribución de las moléculas de una sustancia en función de su masa. Consta de las etapas de volatilización, ionización, aceleración, desviación y detección.

Análisis Proteico

Balance de Nitrógeno

  • N urea = gr urea/día x 0,4662 (12-20g diarios)
  • BN = N ingerido – (N excretado + 2gr)
  • N ingerido = gr proteína x 6,26
  • N excretado = gr urea x 0,46

Análisis Proteico en Órganos

  • Excreción de 3-metilhistidina (3-MH).
  • Determinación de ARN ribosomal (ARNr).

Técnicas para Proteínas Específicas

Western Blot

Técnica para detectar proteínas específicas y sus modificaciones postraduccionales (fosforilación, acetilación). Permite cuantificar la cantidad de proteína mediante el uso de anticuerpos específicos y un estándar de referencia. Etapas:

  1. Electroforesis: separación de proteínas por peso molecular (SDS-PAGE) o punto isoeléctrico (IEF).
  2. Transferencia: paso de proteínas del gel a una membrana.
  3. Inmunodetección: detección de la proteína de interés mediante anticuerpos específicos.

MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight)

Técnica para identificar proteínas nuevas y analizar cambios en el patrón de expresión proteica.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Técnica inmunoenzimática para detectar y cuantificar proteínas. Es sensible, económica y permite procesar múltiples muestras. Se basa en la unión específica antígeno-anticuerpo y la detección mediante una reacción enzimática que genera un cambio de color. Aplicaciones: cuantificación de insulina, detección de gluten, determinación de permeabilidad intestinal, detección de alérgenos.

Inmunofluorescencia

Técnica que utiliza anticuerpos marcados con fluoróforos para detectar proteínas específicas en células o tejidos. Tipos:

  • Inmunohistoquímica: en cortes histológicos de tejidos.
  • Inmunocitoquímica: en cultivos celulares.

Tinciones Específicas

  • Sirius Red: para fibras de colágeno.
  • Oil Red: para cúmulos de grasa (esteatosis).
  • Hematoxilina: para núcleos celulares.
  • Eosina: para el citoplasma y otras estructuras celulares.

Genómica Nutricional

Estudio de la interacción entre genes y nutrientes. Incluye:

  • Nutrigenética: cómo las variaciones genéticas individuales afectan la respuesta a los nutrientes.
  • Nutrigenómica: cómo los nutrientes afectan la expresión génica.

Estudio de Polimorfismos Genéticos

Técnicas Específicas

  • PCR cualitativa y secuenciación del gen de interés.

Técnicas Globales

  • Microarrays.
  • Estudios de asociación del genoma completo (GWAS).