Evaluación de la biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos utilizando Pseudomonas aeruginosa

evaluar a escala d laboratorio la efi100cia en la biorremediación d   suelo contaminado con hidrocarburos utilizando un consorcio d bacterias pseudomona. Aeruginosa

elaborado x:

leidy liliana barrera

leidy johanna Pérez

Universidad central

Facultad d ingeniería

Centro d investigaciones

Bogotá. D. C

27 oct 2016

evaluar a escala d laboratorio la efi100cia en la biorremediación d   suelo contaminado con hidrocarburos utilizando un consorcio d bacterias pseudomona. Aeruginosa

Introducción

1. Planteamiento del problema

realizar un estudio para dar una alternativa dirigido a la recuperación d suelo contaminado con hidrocarburo, donde se determinará una metodología q consiste en someter a las bacterias a 3 condiciones diferentes, la primera mezclado el suelo con un consorcio d bacterias p aeruginosa s.P., la segunda con un caldo nutritivo y la tercera en una alícuota sin ningún compuesto adicional; con el objetivo d determinar el nivel d efi100cia para cada condición y establecer variables comparativas respecto a los escenarios plantea2. La biorremediación d suelos ha demostrado ser una tecnología eficaz para el tratamiento d la contaminación x petróleo, debido a q gran parte d los componentes del crudo y sus productos refina2 son biodegradables

1. 1 descripción del problema

en el suelo los hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmósfera, iniciando una serie d procesos fisicoquímicos simultáneos como evaporación y penetración, q dependiendo del tipo d hidrocarburo, temperatura, humedad, textura del suelo y cantidad vertida, puede ser + o – lenta, ocasionando una mayor toxicidad, además d tener una moderada, alta o extrema salinidad, dificultando su tratamiento.

las técnicas d extracción tradicionales generalmente no garantizan una remoción efi100te del contaminante, lo q nos conduce a generar un estudio donde se evalué con diferentes condiciones la efi100cia d la técnica d remediación a utilizar antes d llevarla a la realidad

la descomposición microbiana d productos deriva2 del petróleo depende siempre d factores específicos del hidrocarburo, y condiciones ambientales q regulan el comportamiento d los microorganismos.

1. 2 delimitación

el área d influencia define el marco d referencia geográfico en el cual se efectuará el análisis y evaluación d la muestra d suelo contaminado para el proyecto. El área d influencia se ha definido sobre la base d las zonas en las cuales se registran tanto los impactos directos produci2 x la contaminación x hidrocarburos, así como los impactos indirectos induci2 sobre las actividades económicas, ambientales y sociales. El área d influencia directa d la contaminación x hidrocarburo corresponde a 4 metros cuadra2, es el terreno en el q se va a estudiar los impactos ambientales directos, es decir aquellos q ocurren en el mismo sitio en el q se produce la acción generadora del impacto ambiental, el área d influencia indirecta d la contaminación x hidrocarburos comprende 80 metros cuadra2 y es el área donde se disipan los impactos ambientales físico bióticos; sin embargo, para caracterizar el componente socioeconómico el área d influencia indirecta es todo el municipio d garzón – huila, ya q sobre su totalidad se generaran los efectos socioeconómicos

1. 3 formulación del problema

¿q beneficios tiene el análisis del suelo contaminado x hidrocarburo tomado en el municipio d garzón – huila?. ¿q factor será determinante para q el estudio arroje resulta2 positivos sobre la cepa d bacterias q se va a utilizar para la degradación d esta muestra?

1. objetivos

2. 1 objetivos generales

elaborar un documento donde se evalué a escala d laboratorio la capacidad biodegradativa d un consorcio bacteriano, mediante 3 pruebas sometidas a diferentes condiciones nutricionales y d temperatura, en suelo contaminado con hidrocarburos tomado d una zona d descarga d esta sustancia en el municipio d garzón – huila.

2. 2 objetivos específicos

• evaluar cuantitativamente en un tiempo d 2 meses la variación d la concentración d hidrocarburo en la muestra d suelo sometida al medio mínimo esencial con el consorcio d bacterias.

• determinar la degradación d hidrocarburo con el fin d establecer el porcentaje (%) d efi100cia d degradación d la bacteria.
  

•  comparar el porcentaje (%) d remoción d hidrocarburo tomando como valores d referencia lo sugerido en la ficha técnica del proveedor.

1. Justificación

las actividades d perforación, explotación, refinación y comercialización del petróleo generan diversos tipos d residuos, los cuales se han vertido sobre los suelos durante décadas, debido a un inadecuado manejo e insufi100te sensibilización ambiental. Como consecuencia, dichos suelos han reducido considerablemente su capacidad natural para sostener a una gran variedad d organismos, restringiendo su capacidad original a tan sólo algunas bacterias oleofílicas, dejando los suelos inutilizables para cualquier tipo d actividad productiva q se quiera realizar (guerrero, 2002). La aplicación d la biorremediación y restauración d suelos contamina2 con hidrocarburos d petróleo, surge como una alternativa viable, ecológica y d gran aceptación. En nuestro país ya se ha iniciado la ejecución d proyectos d biorremediación q consideran la aplicación d esta técnica y se espera q en los próximos años su empleo se incremente.

dado q todo proyecto d biorremediación tiene como 1 d sus principales objetivos la recuperación d la calidad del suelo contaminado, resulta importante evaluar su costo -efectividad.

para aplicar la técnica d la biorremediacion como alternativa d tratamiento para los suelos se ha considerado los siguientes criterios a) los organismos deben tener la actividad metabólica necesaria para degradar el contaminante a una velocidad razonable para alcanzar el nivel guía. B) las condiciones deben propiciar la actividad del micro organismo y el costo del proceso debe ser menor o en el peor d los casos no + costoso q otras tecnologías para remover el contaminante (espinoza 1,999)

la contaminación d suelos con hidrocarburos es un problema cre100te q ha llevado al desarrollo e implementación d tecnologías para la remediación y recuperación d los ambientes contamina2. Las tecnologías d remediación pueden clasificarse d diferentes maneras, sobre la base d los siguientes principios: (i) estrategia d remediación; (ii) lugar en q se realiza el proceso d remediación y, (iii) tipo d tratamiento.

según el instituto nacional d ecología, (2003). Establece q d acuerdo al tipo d tratamiento, las tecnologías d remediación pueden clasificarse en 3 grupos:

g1: tratamientos biológicos: utilizan las actividades metabólicas d ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar, transformar o remover los contaminantes a productos metabólicos inocuos.

g2: tratamientos fisicoquímicos: utilizan las propiedades físicas y/o químicas d los contaminantes o del medio contaminado para separar o contener la contaminación.

g3: tratamientos térmicos: q utilizan calor para incrementar la volatilización, quemar, descomponer o fundir (inmovilización) los contaminantes en un suelo.

la selección d un tratamiento debe considerar los siguientes factores: tipo d hidrocarburos, concentración del hidrocarburo, carácterísticas del lugar donde se realizará la remediación, normativa ambiental, costos y tiempo disponible para la remediación (espinoza 1,999).

los tratamientos fisicoquímicos están + estableci2 actualmente. Sin embargo, su empleo no permite una degradación completa d los contaminantes y además, requieren una alta inversión.

cuando se emplea una técnica biológica se presenta una situación inversa. Los contaminantes son biodegrada2 y los costos d implementación son bajos. X esta razón, existe una tendencia cre100te a emplear tratamientos biológicos.

microorganismos degradadores d petróleo en long beach (california), aplicaron la biorremediación in situ en suelos contaminado con aceite diésel mediante el uso d microorganismos autóctonos complementada con la adición d nutrientes y oxígeno en el suelo bioestimulación (23), e inoculación d una mezcla enriquecida d consorcios bacterianos previamente extraída del mismo suelo bioaumentación. Esto permitíó encontrar consorcios bacterianos degradadores d hidrocarburos identifica2 x secuenciación d genes 16s-rna, demostrando la presencia d bacillus cereus, bacillus sphaericus, bacillus fusiformis, bacillus pumilis, acinetobacter junii, y pseudomonas sp.

el estudio hecho sobre la adaptación y selección d microorganismos autóctonos en medios d cultivo enriqueci2 con petróleo crudo realizado x maría del carmen rivera-cruz 2002 indicó q los microorganismos con crecimiento abundante aisla2 d suelos receptores d derrames re100tes y crónicos d petróleo crudo y otros no contamina2, son considera2 degradadores d petróleo.

los microorganismos aisla2 en suelos poseen actividades d peroxidasas y oxigenadas, q permiten la oxidación d algunas fracciones del petróleo. Esta oxidación cambia las propiedades d los compuestos haciéndolos susceptibles a ataques secundarios y facilitando su conversión a bióxido d carbono y agua.

1. Impacto 100tífico, técnico y social del proyecto

la contaminación d los ecosistemas (terres3 y acuáticos) con petróleo, afecta no solo a la microbiota del suelo sino a la macrocomunidad residente. Así, los efectos perjudiciales del petróleo son vistos mejor sobre la flora dominante d ambientes terres3, aunque paralelamente, es – notorio el efecto ejercido sobre la comunidad animal (la grega, 1996).

surge la necesidad d encontrar soluciones q permitan mitigar los impactos negativos asocia2 a sus carácterísticas fisicoquímicas y propiedades tóxicas, mutagénicas y carcinogénicas (jing ye et al., 2003); siendo la biodegradación d estos compuestos una d las alternativas + efectivas y – exploradas en Colombia.

el desarrollo d este trabajo d investigación pretende brindar fundamentos prácticos para futuros estudios, debido a q representa un gran aporte para las investigaciones relacionadas con la biodegradación d suelos y consecuentemente para el mejoramiento d la calidad ambiental.

5. Marco teórico

5.1 antecedentes

lopólito m. Y col.
2005. Llevaron a cabo experimentos d biodegradación d hidrocarburos utilizando diferentes sustratos como el petróleo, kerosene, aceite lubricante y benceno, y como nutriente un medio mínimo y fertilizante foliar comercial, concluyendo q la inoculación previa acelera el proceso d degradación.

morgan m. Y col. 2005. Aplicaron biorremediación en 20 m2 d suelo contaminado con petróleo, durante 369 días, en este suelo se adicionaron nutrientes inorgánicos, aireación y humedad, obtenién2e valores

abalos a. Y col. 2004. Estudiaron los ramnolípi2 d pseudomonas aeruginosa at10, determinando q la adición d los mismos, acelera la biodegradación d hidrocarburos del petróleo en un 61% en 10 días d incubación.

bracho m. Y col. 2004. Llevaron a cabo un estudio respecto a la degradación bacteriana sobre naftaleno, antraceno, fenantreno y dibenzotiofeno. Las bacterias degradadoras aisladas a partir del suelo estudiado fueron: pseudomonas (54.05%), bacillus (24.30%), staphylococcus (16.20 %) y micrococcus (5.4 %); además determinaron q el 100% d cepas, degradaron el naftaleno y antraceno, el 78.5% fenantreno, el 71.42% dibenzotiofeno y 50% los 4 hidrocarburos.

 pardo j. Y col. 2004. Midieron la efectividad d la biolabranza (landfarming), durante 4 meses, adicionando fertilizantes inorgánicos, obteniendo al finalizar el experimento, un porcentaje d remoción d hidrocarburos del 91%.  

volke t. Y col. 2003. Realizaron un trabajo en biodegradación d hidrocarburos d petróleo y determinaron q los pretratamientos electroquímico y mediante adición d surfactantes, adicionales al composteo, produjeron una degradación del 48% y 46% respectivamente. O zucchi m. Y col. 2003. Evaluaron la respuesta d una comunidad bacteriana durante la biorremediación en un lapso d 72 días con bioestimulación y aireación adecuada, adición d nutrientes y surfactactes obteniendo una reducción final d hidrocarburos del 39.5%.

buckley y col. 1976. Aislaron bacterias y hongos d un ecosistema estuarino no poluido x petróleo o sus deriva2, las especies bacterianas q mostraron capacidad d utilizar hidrocarburos d kerosene como única fuente d carbono fueron caracterizadas en los géneros pseudomonas, corynebacterium, aeromonas, micrococcus y arthrobacter.

margesin r. Y schinner f. 1997. Evaluaron la efi100cia d la biodegradación con microorganismos nativos del suelo , un inóculo psicrotrófico degradador d diésel y el efecto d la bioestimulación x medio d la fertilización inorgánica. Determinaron q la bioestimulación x fertilización, incrementa la biodegradación del diésel x bacterias nativas. Un 16% al 23% d la contaminación se perdíó x procesos abióticos, mientras q el total d decontaminación sin y con fertilizante, estuvo en un rango d 16% al 31% y 27% a 53%, respectivamente.

zhonggi h. 1997. Estudió la manera cómo pseudomonas pseudoalcaligenes js45 utiliza nitrobenceno como única fuente d carbono, nitrógeno y energía; mediante la investigación logró determinar q la cepa en estudio, degrada nitrobenceno mediante una serie d complejas y numerosas reacciones enzimáticas.

mac gillvray a. Y shiaris m. 1994, estudiaron el rol d los microorganismos eucarióticos (levaduras) y procarióticos (bacterias) d un sedimento costero relativo a la biotransformación del hidrocarburo fenantreno x 2 méto2 diferentes: detección d metabolitos marca2 y uso d inhibidores selectivos (estreptomicina y colchicina). Mencionan q tanto levaduras como bacterias pueden transformar el fenantreno, pero la contribución d los microorganismos eucarióticos fue solo del 3%, concluyendo q los degradadores d fenantreno predominantes en dicho sedimento son bacterias y no levaduras.

5.2 teorías fundamentales

la industria del petróleo es hoy una d las + dinámicas en la economía del país. En 1989 los exportadores d café sumaron 1.424 millones d dólares y los del petróleo 1.415 millones. D 1984 a 1989la participación d ecopetrol en los ingresos totales del gobierno pasa del 5.2 a 16.4%. Las cifras + significativas al recordar q el fondo del café, tradicionalmente gran aportante, subíó en ese período d 3.2 a 7.5 x 100to (1)                                         

el derrame d hidrocarburos constituye 1 d los aspectos + relevante para la contaminación del suelo, debido a q sus impactos se manifiestan en un corto o largo plazo, este tipo d impactos q se vuelven constantes a  lo largo del tiempo, lo q  ha llevado a generar una política d desarrollo sostenible + rigurosa, aunque esto no evita q para el caso d los hidrocarburos sea + complejo el control y prevención d este tipo d desas3 ambientales, en la mayoría d zonas catalogadas como “petroleras” se ven afectadas principalmente x actos d vandalismos, e imprudencias d los lugareños quienes x evitar la expansión d esta industrias generan actos d violencia causando afectación del ecosistema q defienden.

dentro d las causas q tratan este tema se define vertimiento al derrame accidental; es decir, no provocado, no deseado, súbito, imprevisible e irresistible, no contable q afecta un recurso natural no renovable. En estos eventos la contaminación puede tener una fuente o varias causas q participan d una forma determinante al desastre contaminador o complicar el problema x los elementos o desechos q d forma independiente no tienen carácter contaminador, pero q x combinación o adición con las fuentes procedentes d la misma u otras, llegan a contaminar.

d la forma + común en las q ocurre la contaminación son:

falla operacional. Se da x un desajuste o asincronismo en la actividad normal d la operación d un oleoducto, un poliducto o estación, ya sea en la manipulación d los

instrumentos o en la parte operativa x parte d los operadores, q ocasiona una sobrepresión d la línea d transporte.

Fatiga d materiales

ocasionado x el inadecuado mantenimiento d las instalaciones, llámese tubo, pozo o múltiple abastecimiento, provocando un pittinges, un agujero x el cual se genera una fuga del líquido.

cuando un derrame es provocado x la acción dolosa d un 3º, en dicho caso es habitual q el origen del mismo se pueda dar x:

Hurto

Cuando los 3ºs q acometen el hecho punible no tienen x motivo nada distinto q obtener un lucro con el crudo q extraen d la tubería.

Acto terrorista

Es aquel q se atribuye x lo general a grupos u organizaciones armadas q enarbolando un carácter político acometen el daño con le interés d desestabilizar.

5.3

6. Formulaciòn d hipótesis

1. si no se aplican metodologías d remediación adecuadas, la contaminación del suelo debida a hidrocarburos del petróleo produce la degradación del mismo afectando sus propiedades físicas y químicas.

7. Méto2 y técnicas d comprobación y/o verificación d hipótesis

1. la biorremedación d la mezcla d una tierra con alta concentración d hidrocarburos con otra d menor concentración, favorece la remoción d hidrocarburos.
2. la presencia d bacterias favorece la eliminación d hidrocarburos en suelos contamina2.

8. Metodología

se tomó una muestra d suelo contaminado con hidrocarburo en el municipio d garzón -huila- el 01 d Agosto d 20165 a las 10:00 am, se transportó hasta bogotá y se refrigeró.

se tomaron 3 alícuotas d 100 gr cada una d la muestra d suelo; la primer muestra se dejó en un vaso d precipitado con 2 ml d caldo nutritivo relación c:n:p 100:10:1, el 2º con 2 ml d la cepa d pseudomona biodyne 101 y la tercera se deja sin ningún tratamiento para q funcione como blanco. Se midió la temperatura y el ph para cada una d las muestras.

las 3 muestras se dejaron en el laboratorio sin tapar ya q la pseudomona realiza el proceso d biodegradación en condiciones aerobias y se sometieron las 3 muestras a las mismas condiciones con el fin d garantizar los parámetros ideales d temperatura (20°c y 40°c) y ph d 7.4 – 7.8°c. Semanalmente y x 2 meses se realizó una aireación manual, una hidratación y la medición d estos parámetros en cada una d las muestras.

con el fin d determinar el hidrocarburo contenido en la muestra se realizó una prueba d grasas y aceites, para lo cual se tomaron 5 gr d suelo d cada una d las muestras preparadas anteriormente y envueltas en papel filtro en forma d rollo se introdujo en el deal d celulosa, se pesó el balón contenido con el benceno del equipo soxhlet q fue lavado y secado a 105°c previamente. Una vez se realizó el montaje se dejó completar el ciclo 4 veces para cada una d las 3 muestras q fueron destiladas. Al finalizar el proceso se tomó el peso d cada 1 d los balones para obtener el contenido d grasas y aceites x la diferencia d pesos.

pasa2 los 2 meses se realizó nuevamente la medición d grasas y aceites en cada una d las muestras para evidenciar x diferencia d resulta2 la variación del hidrocarburo contenido en la muestra inicial y compararlo con el % d remoción q el proveedor d la pseudomona reporta teóricamente.

8.1 diseño del plan d capítulos

Estructura y componentes del suelo

el suelo se define como la parte superior d la corteza terrestre, y está compuesto x componentes minerales (meteorización d las rocas), componentes orgánicos (humus y deriva2, biomasa viva y muerta), gas (aire en el espacio existente en los poros), y agua envolviendo partículas y el espacio capilar. En términos generales, está formado x un 50 % d espacio libre (la mitad del espacio poroso ocupada x gases y la otra mitad x líqui2); un 40-50 % d sóli2 minerales (meteorización d las rocas) y un 0,5-5% d materia orgánica (humus y deriva2, biomasa viva y muerta) (brock y madigan, 2000). El suelo constituye la interfaz entre la tierra, el aire y el agua, lo q le confiere la capacidad d desempeñar tanto funciones naturales como d uso antropogénico. Según las proporciones d arenas (2-0,05 mm d diámetro), limos (2-50 µm d diámetro), arcillas (inferior a 2 µm d diámetro) y materia orgánica, principalmente humus y deriva2, existeuna gran variedad d tipos diferentes d suelos. Los componentes minerales y la materia orgánica se distribuyen en el espacio generando una estructura porosa. Los poros pueden contener agua o aire, d manera q existen 3 fases: sólida, líquida y gaseosa. El agua contenida en los poros del suelo contiene sales minerales y nutrientes y es el medio en el cual se puede desarrollar la actividad metabólica d los microorganismos q lo colonizan. El contenido en agua d un suelo puede oscilar enormemente, afectando dicha actividad.

el suelo es fundamental e irremplazable; coordina el crecimiento d las plantas d los ecosistemas terres3 y mantiene los ciclos biogeoquímicos, ya q los microorganismos del suelo degradan virtualmente to2 los componentes orgánicos, inclusive los compuestos xenobióticos y polifenólicos persistentes. Las poblaciones q habitan el suelo incluyen a la macrofauna, mesofauna, microfauna y microflora. Cabe señalar q el 80-90 % d las reacciones biológicas en el suelo son mediadas x microorganismos (nannipieri y badaluco, 2003) siendo las bacterias y los hongos los q llevan a cabo estas reacciones. Es importante considerar distintos puntos q definen al suelo como una estructura compleja:

1.
La población microbiana en el suelo es diversa. Torsvik y col., (1996) calculó la presencia d aproximadamente 6000 genomas bacterianos x gramo d suelo, tomando el tamaño del genoma d escherichia coli como una unidad.

2. la organización estructural d las partículas del suelo confiere una heterogeneidad espacial para los microorganismos, los cuales viven en microhábitats (stotzky, 1997). Las carácterísticas químicas, físicas y biológicas d estos microhábitats difieren en tiempo y espacio, y su tamaño depende del tamaño del microorganismo.
El espacio ocupado x microorganismos vivos representa una pequeña proporción del espacio disponible. Otra carácterística importante es la presencia d “hot spots”, o sea zonas d alta actividad biológica como los agrega2 q poseen propiedades fisicoquímicas especiales; zonas d alta acumulación d materia orgánica y la rizósfera. La ecología, actividad y la dinámica d los microorganismos del suelo puede verse afectada x varios factores ambientales como las fuentes d carbono y energía, los nutrientes minerales, los factores d crecimiento, la composición iónica, la disponibilidad acuosa, la temperatura, la presión, la composición del aire, la radiación electromagnética, el ph, el potencial d oxido-reducción, la superficie, las relaciones espaciales, la genética d los microorganismos y las relaciones entre ellos. Este hecho implica q en un suelo se puedan encontrar una gran variedad d poblaciones microbianas con capacidades metabólicas distintas, condicionadas tb x la biodisponibilidad d las distintas fuentes d carbono y energía, q a su vez está condicionada x las carácterísticas fisicoquímicas propias d cada suelo (kästner, 2000b). Cabe señalar q casi el 80-90% d los microorganismos q viven en el suelo permanecen sobre superficies sólidas x medio d distintos mecanismos, entre ellos gracias a la producción d polisacári2 extracelulares q interactúan con las partículas d arcilla formando así fuertes complejos q persisten incluso luego d la muerte del microorganismo (nannipieri y col. 2002).

3.
La fase sólida tiene la propiedad d adsorber moléculas biológicas importantes como proteínas y áci2 nucléicos. X ejemplo, algunas enzimas extracelulares pueden mantener su actividad siendo adsorbidas x minerales d la arcilla o atrapadas x los áci2 húmicos.

tb el adn puede ser adsorbido a estas estructuras mantenién2e su integridad, posibilitando d esta forma los procesos d transferencia d material genético (transformación) (pietramellara y col., 1997).

4. la superficie d los componentes minerales del suelo pueden catalizar muchas reacciones x ejemplo los minerales d las arcillas y mn (iii y iv) y el óxido d fe (iii) catalizan las reacciones d transferencia d electrones como la oxidación d fenoles y polifenoles con la formación d las sustancias húmicas (nannippieri y col., 2003).

Suelos contamina2 con hidrocarburos

durante las maniobras d extracción, procesamiento y transporte d los hidrocarburos, los suelos están continuamente someti2 a derrames accidentales. Cuando un suelo recibe un derrame cambia sus carácterísticas, tanto químicas como biológicas. Desde el punto d vista químico, la principal modificación consiste en un incremento enorme del contenido d carbono (c). Este aporte d c altera la relación c:n:p.

desde el punto d vista biológico, la presencia d los hidrocarburos en un suelo causa una reducción notable d la diversidad d las comunidades q lo habitan (castle y col., 2006). A nivel biológico los hidrocarburos resultan un factor d s3s (adicional a los existentes en el suelo) q condiciona el desarrollo d los diferentes componentes d la comunidad microbiana, permitiendo el crecimiento d aquellas poblaciones con capacidades metabólicas adecuadas (y q pueden utilizar la presencia del hidrocarburo como fuente d c y e), obligando a permanecer en formas d resistencia a otros (aquellos q pueden tolerar la presencia del hidrocarburo pero no pueden aprovecharla como una ventaja, al – en ciertas condiciones) y eliminando a aquellos q resultan sensibles.

los suelos contamina2 suelen diferenciarse en 2 categorías, “suelos contamina2 en forma aguda” o “suelos contamina2 en forma crónicas”, en base a su grado y tiempo d exposición a los contaminantes.

un suelo prístino (sin exposición previa a los hidrocarburos) q recibe d manera repentina una gran 2is d hidrocarburos puede ser definido como “suelo contaminado en forma aguda”. El aporte repentino del contaminante condicionará el desarrollo d diferentes miembros d la comunidad microbiana, permitiendo el establecimiento y colonización d los mejores adapta2 a la nueva condición. Así mismo, y según la composición química del contaminante, este se distribuirá en la matriz según procesos d adsorción a las partículas del suelo, percolado a zonas + profundas, y/o eliminado x volatilización.

x el otro lado, un suelo q sufríó un evento d contaminación q ocurríó hace tiempo o q recibe un evento d contaminación constantemente, pueden considerarse como un “suelo contaminado en forma crónica”.

los suelos crónicos se distinguen d los agu2 xq en los 1ºs se pueden encontrar proporciones significativas d microorganismos adapta2 a las condiciones d s3s generado x la contaminación y x lo tanto capaces d tolerar y degradar los contaminantes. Estos microorganismos han logrado colonizar el suelo consumiendo las fracciones disponibles y fácilmente degradables. Consecuentemente y con el transcurso el tiempo, las fracciones disponibles se irán agotando y se acentuarán los procesos d adsorción.

este proceso d “envejecimiento” se produce x una serie d fenómenos como son: la adsorción con la materia particulada del suelo dentro d pequeños poros (0.2-0.8 µm) inaccesibles para las bacterias; la absorción a la materia orgánica del suelo; la baja difusividad d los compuestos, principalmente desde los microporos; la disolución en fases líquidas no acuosas (en inglés napls); la formación d uniones covalentes con la materia orgánica e inorgánica del suelo o bien su dispersión en aguas subterráneas d sitios contamina2 (nannippieri y col., 2003).

d esta manera, la adsorción x la fase sólida, el pequeño tamaño d los poros, la alta tortuosidad del sistema y la disolución en la fase liquida no acuosa, conducirán a una reducida difusión d las moléculas, varios órdenes d magnitud + baja q en el agua (johnsen y col., 2005).

como consecuencia del proceso d envejecimiento la fuente d c resultará poco disponible para los microorganismos, condicionando el crecimiento a las estrategias q puedan desarrollar para superar esta limitación. Convencionalmente se considera biodisponible a un hidrocarburo u otro sustrato, si se encuentra disuelto en la fase acuosa accesible al microorganismo y no biodisponible si está asociado a algún adsorbente (bastiaens y col., 2000).

si bien el aprovechamiento d la biodegradación bacteriana d los hidrocarburos es una vía posible para lograr la “limpieza” d suelos contamina2 (leí y col., 2004; vacca y col., 2005), la reducida biodisponibilidad d estos compuestos constituye una d las principales limitaciones del proceso debido a q se encontrarán poco accesibles para los microorganismos (kanaly y harayama, 2000). Una alternativa aplicable a suelos crónicamente contamina2 es optimizar el potencial degradador d esta microbiota autóctona, con la nivelación d los nutrientes esenciales para su crecimiento y supervivencia.

con la intención d superar la barrera q representa la baja disponibilidad del contaminante, actualmente han sido publica2 numerosos trabajos sobre las estrategias q han desarrollado los microorganismos aisla2 bajo condiciones limitantes del hidrocarburo (johnsen y col., 2005; johnsen y col., 2007; coppotelli y col., 2010; lópez, 2011, trabajo d tesis; días, 2006). La aplicación d estos microorganismos como inoculantes en suelos crónicos, podría resultar en la exitosa reducción del contaminante.

Estudio d la diversidad microbiana

la diversidad microbiana es un término general q comprende la diversidad genética, q es la cantidad y distribución d la información genética d las especies microbianas; la diversidad d las bacterias y los hongos q forman parte d las comunidades microbianas; y la diversidad ecológica, q es la variación en la estructura d las comunidades, la complejidad d las interacciones, el número d niveles tróficos y el número d agrupaciones. Así, la diversidad microbiana incluye el número d las distintas especies bacterianas y fúngicas (riqueza) y su abundancia relativa en la microflora del suelo (Kennedy y smith, 1998).

es importante tener en cuenta q solo un 1-10 % d los microorganismos del suelo son realmente cultivables. Los estudios clásicos d diversidad microbiana basa2 únicamente en el aislamiento d microorganismos representarían tan sólo una parte minoritaria d la diversidad real existente (torsvik y col., 2003). Es probable q tan reducido margen d cultivo sea debido a la interdependencia entre microorganismos, a la imposibilidad d crear las condiciones ambientales q enfrentan realmente los microorganismos en el suelo, y tb el hecho q alg1s microorganismos son cultivables tan sólo bajo ciertas condiciones fisiológicas (heuer y col., 2001).

las técnicas dependientes d cultivo presentan una importante ventaja, q es la posibilidad d obtener cultivos puros, útiles para estudios posteriores, y permiten obtener información acerca d actividades metabólicas d interés. Entre las + aplicadas citamos: el cultivo en placa d microorganismos en medios sintéticos d laboratorio, la estimación del número + probable (nmp) q consiste en la siembra d diluciones seriadas d la muestra en un medio d cultivo líquido adecuado, y estimación del nmp, en base a la turbidez obtenida luego d un tiempo d incubación; la siembra en policubetas d ecoplate (biolog®) q consiste básicamente en la inoculación d un volumen d una dilución adecuada d la muestra, en pocillos d una policubeta conteniendo diversos sustratos. La técnica permite estimar un perfil fisiológico d la comunidad, a través d la utilización d los sustratos, revelado x un indicador redox (el fantroussi y col., 1999).

actualmente, existen técnicas moleculares disponibles q ofrecen la posibilidad ampliar el marco d estudio y analizar la estructura, composición y cambio poblacional d las comunidades microbianas del suelo. Estas técnicas son independientes d cultivo y d acuerdo a su sensibilidad pueden ser aplicadas con diferentes fines, como el d detectar grupos taxonómicos. Entre estas técnicas, encontramos:

1. Análisis d áci2 grasos d los fosfolípi2 d membrana (plfa): se basa en el análisis d los componentes fosfolipídicos d las membranas celulares d los microorganismos del suelo. Esta técnica es útil para detectar cambios rápi2 en la estructura d las comunidades microbianas, pero no para asignar afiliaciones filogenéticas en una mezcla ambiental. (nannipieri y col., 2003).

2. Análisis d restricción d genes rrna (ardra): se basa en la amplificación los genes rrna mediante la reacción d pcr a partir del dna total d una comunidad microbiana. Los fragmentos d dna obteni2 x pcr, pueden ser clona2 y analiza2, o bien x restricción, o bien con el uso d sondas específicas, y finalmente, los clones pueden ser secuencia2 (viñas canals, 2005).

3. Polimorfismo d longitud d los fragmentos terminales d restricción (t-rflp): se utiliza para el análisis rápido y sensible d la diversidad d comunidades microbianas. Se utilizan los productos d pcr d genes rrna, en los q se ha marcado con un agente químico fluorescente, 1 d los 2 cebadores. Los productos son digeri2 con enzimas d restricción y separa2 mediante una electroforesis capilar o en poliacrilamida, en un secuenciador d adn. El tamaño d los diferentes fragmentos terminales es determinado mediante un detector d fluorescencia, generando perfiles reproducibles q caracterizan a la comunidad (liu y col., 1997).

4. Hibridación in situ con sondas fluorescentes (fish): las moléculas d rrna d las células se hibridan con sondas específicas marcadas con agentes químicos fluorescentes, directamente sobre la muestra previamente fijada y permeabilizada. Las células se visualizan en un microscopio d epifluorescencia pudién2e comparar cuantitativamente la población total analizada con la población específica q hibrida con la sonda utilizada (hicks y col., 1992).

5. Gel d electroforesis con gradiente desnaturalizante (dgge y tgge) (heuer y col, 2001): permite detectar rápidamente d un modo cualitativo y semicuantitativo (relativo) los diferentes productos d pcr d genes 16srrna d la comunidad. Con un gradiente desnaturalizante d urea y formamida (o d temperatura para tgge) optimizado, se corren los productos d pcr a analizar en un gel d electroforesis y los fragmentos d adn d = tamaño pero distinta secuencia, se separan y resuelven electroforéticamente. Se asume q cada banda d dgge (o tgge) obtenida representa una unidad taxonómica operativa (otu), la cual se puede denominar con el término especie para simplificar el análisis (canals, 2005). Se pueden estudiar moléculas d dna d hasta 700 pares d bases d longitud, con la carácterística d llevar acoplada una cola artificial muy rica en gc en 1 d los extremos, para evitar la desnaturalización completa del dna (muyzer y col., 1998).

el conocimiento d la diversidad microbiana ha sido mejorado muy significativamente sobre la base d la utilización re100te d las técnicas no dependientes d cultivo. En el caso d este trabajo d tesis, se utilizó la técnica d dgge para realizar los análisis d las comunidades bacterianas.

Biorremediación d suelos contamina2 con hidrocarburos: una tecnología amigable

en las últimas décadas, con el objetivo d eliminar hidrocarburos d suelos contamina2, se han desarrollado diferentes estrategias económicamente atractivas y + amigables con el medio ambiente q los méto2 físicos/químicos disponibles. Todas ellas se basan en el aprovechamiento d las capacidades metabólicas d los microorganismos para degradar los contaminantes y reciben el nombre genérico d procesos d biorremediación.

la biorremediación podría definirse como una biodegradación asistida y controlada q provee una solución definitiva, diferencián2e d otras tecnologías q solo proveen una solución temporal mediante el aislamiento y contención del contaminante (crawford, 2002).

esta tecnología utiliza microorganismos, componentes celulares o enzimas libres, con el fin d lograra la mineralización o bien una transformación parcial del contaminante en sustancias – tóxicas o inocuas para el medio ambiente y la salud humana (röling y col., 2001). Aunque no to2 los compuestos orgánicos son susceptibles a la biodegradación, los procesos d biorremediación se han utilizado con éxito para tratar suelos o lo2 y sedimentos contamina2 (lina, 2010) incluso d ambientes fríos (ruberto, 2009).

al = q otras tecnologías d remediación, la biorremediación puede realizarse in situ, es decir en el mismo lugar, u on site lo cual implica excavar el material y tratarlo dentro del área afectada. Otra alternativa es el tratamiento ex situ, donde se puede excavar el material y trasladarlo fuera del lugar contaminado (velasco y volke sepúlveda, 2003).

la biorremediación in situ es la + aplicada ya q trata el contaminante en el lugar, aprovechando la capacidad degradadora d los microorganismos autóctonos del sitio (benavides lópez d mesa y col., 2006). Particularmente la biorremediación on site d suelos contamina2 d la antártida ha resultado ser, hasta el momento, la mejor opción debido a q evita el alto costo económico q implica el traslado d material al continente, para su tratamiento.

Factores q condicionan la biorremediación d un suelo

la biodegradabilidad d una mezcla d hidrocarburos presente en un suelo contaminado depende d diversos factores como son: la presencia d una comunidad microbiana degradadora potencialmente activa, la estructura molecular del contaminante, su concentración y biodisponibilidad, y factores ambientales como la, temperatura, el ph, humedad del suelo, presencia d aceptores d electrones, y la existencia d nutrientes inorgánicos (fuente d n y p) disponibles.

1. El ph, temperatura y la humedad cada cepa microbiana tiene un determinado rango d tolerancia a factores ambientales como son: la temperatura, el ph y la salinidad, los cuales pueden afectar al crecimiento y actividad d las poblaciones microbianas. En consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad d microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango d tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas q sean óptimas en to2 los casos, pero en términos generales los rangos óptimos para la biodegradación son: ph entre 6-8 y temperaturas entre 20-30 ºc (alexander, 1999).

la variación del ph del suelo afecta a la actividad microbiana y tb a la solubilización y adsorción/absorción d los contaminantes y d los iones. Las formas catiónicas (nh4+, mg2+ , ca 2+) son + solubles a ph ácido mientras q las formas aniónicas (no3 – , no2 – , po4 3- cl- ) son + solubles a ph alcalino (sharpley, 1991). En general, el ph óptimo para el crecimiento d las bacterias heterótrofas es neutro (ph 6-8), mientras q es + ácido para los hongos (ph 4-5).

la humedad del suelo puede limitar d forma severa la biodegradación, fundamentalmente en suelos superficiales afecta2 x oscilaciones importantes en el contenido d agua. No obstante, el nivel óptimo d humedad depende d las propiedades d cada suelo, el tipo d contaminación y si la biodegradación es aeróbica o anaeróbica. Un déficit d agua puede disminuir el transporte d nutrientes y d contaminantes, así como tb la migración bacteriana a través del suelo. El exceso d agua en un suelo desplaza el aire residente en los poros del suelo, generán2e con mayor facilidad condiciones anaeróbicas, al agotarse el oxígeno disuelto en agua (menn y col., 2000).

2. Estructura química

d las distintas familias d hidrocarburos del petróleo, los nalcanos y los alcanos ramifica2 (isoprenoides) d cadena intermedia (c10-c20) son los sustratos + fácilmente degradables x los microorganismos del suelo, tendiendo a ser eficazmente biodegrada2. Sin embargo, los alcanos d cadena larga (>c20) son + difíciles d degradar debido a su elevado peso molecular y su baja solubilidad en agua. Los cicloalcanos, x norma general, se degradan + lentamente q los n-alcanos y alcanos ramifica2. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (haps) d 2 a 3 anillos pueden ser biodegrada2 eficazmente en el suelo en condiciones ambientales óptimas, mientras q los hap d 4 anillos, y especialmente, los d 5 o + anillos bencénicos presentan una mayor recalcitrancia y una baja solubilidad. Las fracciones d resinas y asfaltenos son las q presentan una menor degradabilidad debido a las complejas estructuras químicas y a su elevado peso molecular (harayamay col., 1997, 1999).

3. Biodisponibilidad

1 d los factores limitantes d la biodegradación d contaminantes en suelo crónicamente contamina2 es la biodisponibilidad. La adsorción x la fase sólida, el pequeño tamaño d los poros, la alta tortuosidad del sistema y la disolución en la fase liquida no acuosa del suelo, conducirán a una reducida difusión d los hidrocarburos, disminuyendo la disponibilidad hacia los microorganismos (johnsen y col., 2005).

4. Presencia d aceptores d electrones la mayor parte d los hidrocarburos del petróleo y deriva2 son degrada2 con mayor extensión y rapidez d forma aeróbica (o2 como aceptor final d electrones), ya q en ausencia d o2, y en presencia d aceptores d electrones alternativos (no3-, so4 2- , co2 , mn4+ y fe3+) los hidrocarburos pueden ser degrada2, pero con unas tasas d biodegradación muy inferiores a las aeróbicas (massias y col., 2003).

5. Nutrientes inorgánicos

Las concentraciones d nitrógeno y fósforo asimilables presentes en el suelo, suelen ser limitantes para un incremento y activación d la población microbiana, mientras q otros nutrientes esenciales como el ca2+, na+ , fe2+ y so4 2- ya están presentes en cantidades sufi100tes en el suelo (menn y col., 2000). El enfoque d la biorremediación consiste en una modificación ambiental q incentiva la capacidad degradadora intrínseca d los microorganismos del suelo. Han sido desarrolladas diferentes estrategias con el fin d aumentar la capacidad degradadora del suelo. La bioestimulación y el bioaumento son algunas d las + extensamente estudiadas.

8.2 recolección d la información

la recolección d la información se puede tomar d 2 fuentes:

las fuentes secundarias y las fuentes primarias.

8. 2.1 fuentes secundarias:

l información q incorporamos en este trabajo alguna fue tomada d libros y páginas d Internet.

8.2. 2 fuentes primaras: La fuente primaria fue la q obtuvimos d los análisis desarrolla2 en laboratorio

9. Procesamiento d datos

los datos fueron tomado mediante transcurría los días

9.2 tabulación

10. Análisis d la información

se relacionan el comportamiento d estas 2 variables a través del tiempo en cada 1 d los casos:

se evidencia q estas 2 variables tienen un comportamiento inversamente proporcional a través del tiempo ya q la temperatura inicial era alta y el ph neutro, a medida q transcurren las semanas empieza a aumentar el ph y a disminuir la temperatura q aunque permanecen en el rango establecido para la biorremediación, no se mantienen entables x lo q se puede determinar q no hay presencia d bacterias endógenas q sean capaces d degradar el hidrocarburo contenido en él.

se evidencia q las condiciones iniciales en el suelo no brindan los parámetros ideales para garantizar una degradación, sin embargo al paso d una semana después d una interacción del suelo con los nutrientes del caldo se logra una estabilización d las variables y se vuelven directamente proporcionales aunque d la semana 3 a la 5 disminuye radicalmente el ph y la temperatura es + alta, desde la semana 6 se evidencia una estabilización d las variables. X lo q se podría inferir q el caldo genera mejores condiciones q pueden favorecer el desarrollo d microorganismos degradadores d los compuestos d hidrocarburos conteni2 en el suelo.

se evidencia q durante el proceso las variables d estudio conservan las proporciones directas y q durante las 3 primeras semanas el ph y la temperatura permanecieron elevadas hasta un punto d inflexión donde ambas variables disminuyen significativamente hasta lograr el equilibrio nuevamente en la semana 8.

se puede observar q d las 3 condiciones a las q fueron sometidas las 3 muestras, fue + estable en el medio con la pseudomona ya q mantuvo las 2 condiciones dentro d los parámetros requeri2 para el desarrollo del consorcio d bacterias.

grasas y aceites

las 3 muestras fueron sometidas a la prueba d grasas y aceites en el equipo soxhlet donde se obtuvo lo siguiente:

11. Hallazgos / resulta2 d la investigación

12. Conclusiones

• el consorcio d p. Aeruginosa es efi100te para realizar procesos d biorremediación en suelos contamina2 con hidrocarburos.
• d acuerdo a la variación d la concentración d hc en las muestras d suelo en un periodo d 2 meses se puede evidenciar q la cepa si degrada
• el consorcio d bacterias es efi100te en un 75% teniendo en cuenta la degradación d hc en la muestra d suelo.
• la biodegradación es efi100te en un 75 % respecto al 85% q sugiere el proveedor del consorcio d bacterias, teniendo en cuenta q el porcentaje d remoción d hc fue d 75%

13. Recomendaciones

• realizar una adición d nutrientes + amplia en el tiempo, a las muestras, según el seguimiento d las concentraciones d nutrientes a lo largo del tiempo d la investigación, para manejar condiciones óptimas d estos parámetros en el suelo.
• los hidrocarburos totales d petróleo son compuestos químicos muy contaminantes q deben ser evalua2 en diferentes ambientes, con el fin d buscar alternativas d tratamiento q permitan mejorar sus condiciones antes d su disposición final. Estas problemáticas se vienen estudiando a nivel d laboratorio, sin embargo, se deben plantear investigaciones a escala real.
• utilizar diferentes pruebas bioquímicas para la identificación d diferentes microorganismos presentes en estos suelos q degradan los hidrocarburos.
• se recomienda considerar en las variables d seguimiento introducir pruebas d textura para los suelos.
• para futuras investigaciones se deben realizar análisis d correlaciones o multivaria2, para afirmar q los comportamientos d las propiedades microbiológicas se deben a un parámetro en particular, bien sea temperatura, ph, humedad, entre otros.

Bibliografía

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• gómez, s (2008). Factores bióticos y abióticos q condicionan la biorremediación x pseudomonas en suelos contamina2 x hidrocarburos. Issn:1794-2470 vol 6. Nova publicación 100tífica en 100cias biomédicas. Bogotá.

• prt-701-02-033. Rev n°1. Procedimiento para determinar materia grasa, método hidrólisisi ácida –spxhlet. Instituto d salud pública d Chile. Subdepartamento laboratorios del ambiente.
• alcaldía d garzón huila recuperado el 12 d Abril del 2015 d http://www.Garzón-huila.Gov.Co/informacion_general.Shtml
• ficha técnica biodyne 101 (Octubre d 2013). Inoculante ambiental en forma líquida. Fabricado x biodyne, inc sarasota, florida-esta2 uni2-.

es una parte q se toma d un volumen

alfonso avellaneda. Articulo “petróleo e impacto ambiental en Colombia”universidad nacional d Colombia  http://www.Bdigital.Unal.Edu.Co/41162/1/12208-31104-1-pb.Pdf

domingo gómez. Articulo “responsabilidad x daño ambiental en la actividad petrolera d Colombia” en responsabilidad x daños ambientales. Universidad externado d Colombia. 2001.P.123