Cinética Enzimática e Inhibición: Guía completa de bioreactores y crecimiento microbiano

1. Significado fisiológico de los parámetros r_max, K_M, k₂ de la ecuación de Michaelis-Menten empleando la hipótesis de estado pseudo-estacionario de Briggs y Haldane

La hipótesis de estado pseudo-estacionario de Briggs y Haldane supone nula la velocidad neta de formación del complejo ES, es decir, que la concentración de ES es constante, teniendo: (E+S<–>ES–>P+E). Esto implica que K_M se define como el cociente de las constantes cinéticas de descomposición y de formación del complejo ES, es decir: K_m=(k_-1 + k₂)/k₁. El significado de k₂ pues no cambia, y es la constante cinética de la segunda reacción, que es irreversible. r_max seguirá siendo la velocidad máxima de la reacción, es decir, cuando todos los sitios activos de la enzima estén trabajando constantemente para llevar a cabo la reacción, o cuando C_s >>> E.

2. En procesos de catálisis por enzimas describir en que consiste la inhibición competitiva por una sustancia extraña y en qué se diferencia de la inhibición por el sustrato

Una inhibición competitiva por una sustancia extraña consiste en que una sustancia ajena a la reacción enzimática de interés se une con cierta afinidad a la enzima, compitiendo con el sustrato por el mismo centro activo. Esto radica en una reducción de la cantidad de enzima disponible para interaccionar con el sustrato y, por lo tanto, en una reducción de la velocidad de reacción. Por otra parte, en la inhibición por sustrato el propio sustrato induce la formación de un complejo ESS no reactivo, que reducirá la velocidad de reacción al disminuir los sitios activos disponibles de la enzima. La principal diferencia entre ambos es que, en una inhibición competitiva, al competir con una sustancia distinta, se puede contrarrestar el efecto del inhibidor simplemente aumentando la concentración de sustrato. En una inhibición por sustrato, un aumento de la C_s por otra parte llevará a un aumento en la inhibición. Habrá un valor de C_s para el cual la velocidad de reacción será máxima, y a partir del cual esta disminuirá progresivamente.

3. Fases del crecimiento de una población de microorganismos. Enuméralas y escribe sus características brevemente

Fase de Adaptación Celular o Fase de Retardo: No hay crecimiento ya que las células se están adaptando a las condiciones, y será tan largo como diferentes sean las condiciones respecto a su medio anterior.
Fase de Crecimiento Exponencial: En esta fase se produce el compuesto seleccionado y el objetivo de un proceso de fermentación será maximizar esta etapa.
Fase Estacionaria: En el que no hay crecimiento debido al agotamiento de nutrientes o a la acumulación de productos que inhiben el crecimiento.
Fase de Muerte:

4. En el crecimiento celular con inhibición por el producto P, la ecuación cinética más común incluye los parámetros μ_max, K_m, n y C_p*. Señalar el significado físico de dichos parámetros y escribir la ecuación cinética de crecimiento celular

µ_max es un parámetro que corresponde a la velocidad específica de crecimiento celular máxima, siendo la µ la velocidad específica de crecimiento, que se define como la variación del logaritmo neperiano de la concentración de microorganismos o células en el tiempo: µ= d ln (C_M)/dt. La µ_max sería la máxima a la que puede llegar en una reacción concreta. La K_M es la constante de Monod, que es un parámetro del sistema análogo a la constante de Michaelis, pero sin significado físico en este caso. La n es adimensional. Por último, la C_P* es la concentración máxima de producto a la que hay crecimiento. Es decir, la concentración de producto que causa que la velocidad de formación de biomasa sea nula.

5. Descubrir cómo varían con el tiempo las siguientes variables en un reactor fed-batch de dos etapas (reacción con microorganismos): volumen total, C_m, C_s y C_p (cinética de crecimiento microbiano de Monod)

En un reactor fed-batch de 2 etapas, el sustrato se alimenta en 2 cargas sucesivas y no se retira el producto, variando el volumen de la reacción. Por lo tanto, el volumen total prácticamente se doblará cuando se alimente la segunda carga. La C_m y la C_p aumentarán progresivamente hasta que se añada la segunda carga, en cuyo momento bajarán debido al aumento de volumen, y de nuevo aumentarán hasta que se consuma el sustrato. El sustrato se comportará a la inversa, irá disminuyendo progresivamente hasta que se añada la segunda carga, cuando volverá a aumentar súbitamente y después una vez se empiece a consumir de nuevo, descenderá otra vez.

6. ¿En qué consiste el criterio de esterilización? Alcance y objetivos

La esterilización consiste en eliminar microorganismos ajenos al proceso de fermentación. Sin embargo, el factor delta, el que se usa para cuantificar el proceso de eliminación de microorganismos, se define como el logaritmo neperiano entre el nº de células iniciales y finales. Al ser un logaritmo, el nº de células finales no puede ser 0 porque el tiempo necesario tendería a infinito, por lo que en la práctica n_M se fija como una fracción de individuo, de manera que se trabajará en probabilidades. Es decir, si n_M se fija en 0,001 esto implicará una probabilidad de 1 entre 1000 de que un individuo sobreviva a la esterilización. El objetivo es pues esterilizar al máximo el diseño, pero sin hacer demasiado largo el periodo de esterilización, fijando una probabilidad aceptable de que subsista la contaminación tras la esterilización.

7. Describir cualitativamente el proceso de esterilización de un medio de reacción líquido en discontinuo

Una esterilización en discontinuo tendrá tres etapas en serie. Una de calentamiento del líquido desde la temperatura de carga a la temperatura de esterilización, una fase de temperatura estacionaria en la que se mantiene constante, y una de enfriamiento, desde la temperatura de esterilización hasta la temperatura de trabajo, cuando se podrá meter la cepa útil. En cada etapa se eliminarán células por lo que la suma de la reducción celular en cada etapa será la eliminación total, y se deberá tener en cuenta el tiempo necesario para cada etapa considerando la reducción de células que se quiere conseguir.

8. ¿En qué condiciones es idóneo utilizar un fermentador de tanque agitado y uno tubular conectados en serie?

El diseño óptimo de fermentadores dependerá de la concentración de sustrato en el alimento y a la salida, así como de la forma que tenga la curva de (1/-r_S) = f(C_S). En general, se buscará minimizar al mínimo el volumen del reactor con el objetivo de obtener el cambio deseado en la concentración de sustrato en la corriente a tratar. En este caso, será idóneo emplear 2 reactores en serie cuando se tenga un C_S,0 > C_{S, opt} en la alimentación y un C_S < C_S,opt a la salida.

9. Describir el modelo de flujo de mezcla perfecta. ¿Cómo varía con la posición (entrada, reactor, salida) la concentración de organismo, sustrato y producto? Hacer una representación gráfica si es preciso.

El modelo de flujo de mezcla perfecta es aquel en el que se asume una distribución homogénea en todos los puntos del reactor, tanto de concentración como de condiciones (HACER DIBUJO).

10. Describir el modelo de flujo en pistón. ¿Cómo varía con la posición (entrada, reactor, salida) la concentración de microorganismos, sustrato, producto? Hacer una representación gráfica si es preciso.

En este modelo, no hay homogeneidad dentro del biorreactor. Hay un gradiente positivo de producto y de microorganismos y un gradiente negativo de sustrato hacia la salida del biorreactor. Eso se debe a que a medida que la reacción se lleva a cabo, van avanzando los componentes horizontalmente hacia la salida. Por eso al principio encontramos mucho sustrato, unos pocos microorganismos (a diferencia del modelo de flujo de mezcla perfecta, es imperativo que el caudal de entrada contenga microorganismos) y nada de producto. De esta forma, cuando los flóculos han llegado a la salida, los contenidos en producto y microorganismos son máximos y la concentración de sustrato es mínima.